В. С. Коничев
Руководство к практическим занятиям по цитологии
Занятие № 2
Опрос по предыдущей теме: история цитологии, клеточная теория, клетки прокариот и эукариот, растений и животных, микроскопическая техника, клеточный цикл, стволовые клетки.
Тема занятия: «Изучение клеток с помощью световой микроскопии и специфических методов окрашивания».
Цель занятия:
1. Ознакомить студентов с методами цитохимии.
2. С помощью световой микроскопии изучить препараты, окрашенные на жир и гликоген.
Объяснение преподавателя
Специфические методы окрашивания, или цитохимия
Цитохимия – это область цитологии, которая изучает содержание и распределение химических соединений внутри клетки, а также динамику их превращений в процессе жизнедеятельности.
Методы цитохимии подразделяются на две большие категории. К первой группе относятся методы, основанные на использовании специфических красителей, взаимодействующих с конкретными химическими соединениями, образуя прочные химические связи. Например, при окрашивании суданом черным в клетках выявляются жиры в виде черных капель, структуры ядра и цитоплазмы остаются бесцветными.
Вторая группа методов цитохимии основана на проведении химической реакции непосредственно на срезе на предметном стекле. Реакция проводится таким образом, чтобы гидролизовать изучаемое химическое соединение, но при этом должны образоваться специфические реакционные группы, способные взаимодействовать с определенным красителем. Условия гидролиза для каждого соединения подбираются индивидуально. Например, обесцвеченное основание фуксина, взаимодействуя с альдегидными группами, образует прочное соединение, которое в присутствии сернистой кислоты окрашивается в красный цвет. Это свойство обесцвеченного основания фуксина используется для специфического окрашивания гликогена или ДНК в клетках, но гидролиз проводится так, чтобы именно на ДНК или на гликогене образовались свободные альдегидные группы. Для выявления ДНК гидролиз проводится при нагревании в соляной кислоте. При окрашивании на гликоген реакцию проводят при комнатной температуре в растворе периодата калия.
В частности, для выявления полисахарида гликогена, мономером которого является глюкоза, предметное стекло с тонкими срезами ткани помещают в раствор периодата калия при комнатной температуре. Такая обработка приводит к разрушению гликогена в клетках и образованию свободных альдегидных групп на глюкозе. Затем препарат помещают в раствор бесцветного основания фуксина, который образует прочное соединение с альдегидными группами. После отмывания препарата в слабом растворе сернистой кислоты места локализации гликогена окрашиваются в красный цвет. Ядро останется бесцветным.
Вопросы
1. Что такое цитохимия?
2. Как можно выявить в клетках жир?
3. Как окрасить клетки на гликоген?
Самостоятельная лабораторная работа студентов
Анализ препаратов, окрашенных разными цитохимическими методами.
С каждого препарата делается цветной рисунок участка ткани, содержащий 3–4 клетки. Предварительно препарат анализируют при увеличении 10×15, затем переходят на большое увеличение (40×15).
Рис. 1. Жировые включения в клетках печени аксолотля. Окраска суданом черным, затем препарат докрашен эозином. Отметить капли жира, ядра клеток.
Жир может накапливаться в различных клетках животных и растений. На данном препарате он выявляется в клетках печени в виде черных капель, адсорбировавших краситель. Капли могут быть разного размера, их количество варьирует на различных препаратах.
Рис. 2. Выявление гликогена в клетках печени аксолотля. Реакция на гликоген, после чего окрашивание фуксинсернистой кислотой, затем препарат докрашен гематоксилином для выявления ядер. Отметить гликоген, ядра клеток со структурами.
В печени депонируются сахара в виде нерастворимого углеводного полимера – гликогена, который является веществом запаса животной клетки. С помощью цитохимической реакции гликоген выявляется в виде глыбок красного цвета непосредственно в цитоплазме.
Задание на дом. Особенности морфологии растительной и животной клетки.
Занятие № 3
Теоретические вопросы: особенности организации клеток растений и животных.
Тема занятия: «Многообразие растительных клеток на примере клеток эпидермиса Setcreasea purpurea».
Цель занятия:
1. Изучить общий принцип организации растительной клетки с помощью световой микроскопии.
2. Показать морфологическое разнообразие клеток листа в зависимости от выполняемых функций.
Объяснение преподавателя
Эпидермис пурпурного листа сеткреазии, близкой родственницы традесканции, представляет собой сложную ткань, имеющую в своем составе клетки, выполняющие две главные функции: регуляцию газообмена и защиту от неблагоприятных условий среды. Это – основные эпидермальные клетки и устьичный аппарат, представленный замыкающими клетками устьиц и околоустьичными клетками. Кроме того, листья сеткреазии обильно опушены с обеих сторон длинными многоклеточными трихомами, видимыми невооруженным глазом. Морфология всех типов клеток различна и связана с их функциями.
Основные эпидермальные клетки сеткреазии схожи по морфологии. Они имеют 5–6-угольную форму, могут быть изодиаметрическими или удлиненными. Их боковые стенки прямые. Размеры основных эпидермальных клеток этих растений значительно превышают средние показатели для высших растений (10–100 мкм) и составляют 160–180 мкм, что связано с произрастанием во влажном и теплом климате.
Нижняя сторона листа сеткреазии окрашена в пурпурный цвет. При рассмотрении эпидермиса под микроскопом видно, что окрашены не все основные эпидермальные клетки, а лишь отдельные. Окрашенные клетки собраны в группы по 2–3 или рассеяны по одиночке. Окраска связана с наличием антоцианового пигмента в клеточном соке вакуолей. В клетках хорошо выявляется структурированное ядро диаметром 16 мкм. Хлоропласты немногочисленны, в клетках нижней стороны листа их количество больше. Форма хлоропластов может быть шарообразной или вытянутой, диаметр 5–7 мкм. В основных эпидермальных клетках сеткреазии хлоропласты часто обособлены в цитоплазматических кармашках, несколько штук в группе. В некоторых клетках имеются лейкопласты разнообразных форм: палочковидные, двояковыпуклые, гантелеобразные, их средний размер 6–12 мкм, обычно они собраны вместе по нескольку штук. Достаточно часто в основных эпидермальных клетках выявляются включения разнообразной формы. Это соли оксалата кальция, которые находятся в полости центральной вакуоли и, скорее всего, представляют собой конечный продукт жизнедеятельности, образующийся как приспособление для выведения из обмена веществ излишков кальция.
Устьичный аппарат расположен на нижней стороне листа выше уровня основных эпидермальных клеток в виде приподнятых устьиц. Такие устьица характерны для растений, произрастающих в условиях избыточного увлажнения. Высокоспециализированные замыкающие клетки устьиц содержат многочисленные хлоропласты. Клетки имеют бобовидную форму, которая может изменяться, что влияет на размер устьичной щели, а следовательно, на интенсивность транспирации. Размер замыкающих клеток – 40–50 мкм в длину. Они окружены четырьмя околоустьичными клетками, которые отличаются по форме и строению от основных эпидермальных клеток. Их размер 40–80 мкм, хлоропласты и лейкопласты отсутствуют, антоциановые пигменты не выявляются.
