Марат Зиявдинович Саидов
Клеточные и молекулярные механизмы патогенеза иммуновоспалительных ревматических заболеваний
2.5. Значение нетоза при иммуновоспалительных ревматических заболеваниях
Нейтрофилы (Нф) принадлежат к той категории уникальных клеток, которые используют смерть в качестве патогенетического механизма модуляции воспаления, вызванного в т. ч. и DAMP, а также обеспечения эффективного удаления микроорганизмов во время инфекционного процесса.
Короткоживущие Нф способны быстро накапливаться в местах повреждения тканей, при наличии или при отсутствии инфекции, оперативно выполнять свои функции и отмирать с помощью механизмов, описанных ниже
Из известных форм запрограммированной и регулируемой гибели клеток у Нф описано по меньшей мере четыре типа – это апоптоз, аутофагическая гибель, некроптоз и нетоз. В процессах модуляции воспаления и элиминации инфекционных агентов принимают участие преимущественно две формы гибели нейтрофилов – апоптоз и нетоз.
Нетоз, или “внеклеточные сети, или ловушки” первоначально был отнесён к механизмам врождённого антиинфекционного иммунитета, реализуемого только Нф. Однако впоследствии этот феномен был выявлен в клетках макрофагально-моноцитарного ряда и назван “метозом” [51].
Экстернализация хроматина с образованием внеклеточных ловушек также обнаружена в эозинофилах, базофилах и тучных клетках [165].
Впервые новая, уникальная форма гибели Нф, несущая в себе функции врождённого антиинфекционного иммунитета, была описана в работе Brinkmann V. с соавт. в 2004 г. [27].
Авторы показали, что Нф, стимулированные IL-8, форбол-миристат-ацетатом (PMA) или липополисахаридом (ЛПС) при экспериментальной дизентерии и аппендиците у человека высвобождают гранулярные белки и хроматин, которые вместе образуют внеклеточные волокна, связывающие грамм-положительные и грамм-отрицательные бактерии. Эти внеклеточные ловушки (сети) обладали бактерицидным свойствами, которые обеспечивали высокую локальную концентрацию противомикробных агентов и предотвращали распространение микроорганизмов. Необходимо отметить важнейшее свойство нетоза, а именно – интенсивную локальную продукцию активных форм кислорода (АФК), обладающих выраженными бактерицидными свойствами. Первоначально этот феномен был описан, как “кислородный взрыв” при фагоцитозе микробов Нф.
Таким образом был открыт альтернативная форма гибели Нф, при котором реализуется эффекторная функция врождённого антиинфекционного иммунитета. Дальнейшее изучение этого феномена, показало активное участие нетоза при аутовоспалительных и аутоиммунных заболеваниях.
Нетоз является следствием последовательных внутриклеточных процессов, приводящих к смешиванию содержимого клеточного ядра с белковыми структурами, вытеснению этих образований из клеток и формированию внеклеточной волокнистой сети способной “захватить” и убить микроорганизмы. Сеть состоит из деспирализованной, транскрипционно неактивной ДНК, связанной с цитруллинизированными гистонами и гранулированными цитоплазматическими белками из первичных, вторичных и третичных гранул Нф, включая компоненты, обладающие воспалительной и бактерицидной активностями. К ним относятся эластаза нейтрофилов (NE), миелопероксидаза (MPO), катепсин G, α-дефензины, лактоферрин, пентраксин 3, желатиназа, протеиназа 3 и пептидогликансвязывающие белки [108].
В этих условиях ДНК нейтрофилов трансформируется в гетерохроматин внутри ядра, при этом ДНК оборачивается вокруг гистонов с образованием нуклеосом. При этом происходит важный при ИВРЗ процесс цитрулинизации гистоновых белков, имеющий важное значение при формировании ауто-АГ [87].
В контексте ИВРЗ триггерами нетоза могут быть следующие внеклеточные и внутриклеточные процессы:
– связывание TLR2 Нф-ов грамположительными бактериями (витальный нетоз);
– связывание липополисахаридов грамотрицательных бактерий с Нф (витальный нетоз);
– опсонизация объекта фагоцитоза Нф компонентами активированной системы комплемента;
– аутофагия;
– связывание иммуноглобулинов и иммунных комплексов через FcγRIIA
– взаимодействие с рибонуклеопротеин – содержащими иммунными комплексами при СКВ
– некоторые аутоантитела (ANCA, сыворотки больных РА, СКВ);
– цитокины (IL-8, IL-17, TNF-α, G-CSF, IFN-α);
– хемокины;
– лектины и селектины;
– совместное культивирование активированных эндотелиальных клеток с Нф
[23, 151].
Помимо бактериальных инфекций, нетоз может быть индуцирован также грибковыми [180], паразитарными [48] возбудителями, а также неинфекционными стимулами – кристаллы мочевой кислоты, кристаллы холестерина, аутоантитела, иммунные комплексы [64].
На рис. 26 представлена картина нетоза, вызванного обработкой Нф форбол-миристат-ацетатом (PMA). Отчётливо видно, что РМА вызывает активный процесс формирования межклеточной сети, в которую вовлекаются все Нф. Создается нечто вроде клеточного конгломерата из активированных нейтрофилов, соединённых сетью в единое целое.
Рис. 26. Картина нетоза, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа
Примечание. Красные стрелки указывают на нейтрофильные сети. Изображение в рамке отражает состояние интактных Нф, по материалам [74]
Не менее выразительны препараты нетоза, полученные методом иммунофлуоресценции. На рис. 27 слева представлены интактные контрольные Нф, а справа Нф, стимулированные в течение 3 часов форбол-миристат-ацетатом (PMA). Нетоз определяется по признакам ремоделирования хроматина, визуализирующегося в виде экстрацеллюлярных структур, включающих в себя деспирализированную ДНК, гистоны и нейтрофильные белки – миелопероксидазу и нейтрофильную эластазу. Последняя, зелёного цвета, обрамляет клеточную стенку.
Рис. 27. Нетоз, индуцированный 3-часовой инкубацией Нф с 50 nM PMA
Примечание. а – интактные Нф, b – РМА-стимулированный нетоз.
Зелёная флуоресценция – МАТ к нейтрофильной эластазе; красная флуоресценция – МАТ к хроматину; ДНК, меченная краской Hoechst – голубая флуоресценция. Метод иммунофлуоресценции, по материалам [14]
Идентифицированы несколько форм нетоза, различающиеся по внутриклеточным механизмам, а также по функциональному предназначению.
Первая форма – суицидальный нетоз. Это медленный процесс (от 120 до 240 минут), первым этапом которого является сборка и активация комплекса NADPH-оксидазы (Nox), способствующей образованию активных форм кислорода (АФК) [3]. АФК обладает выраженными бактерицидными свойствами, но также повышает протеолитическую (а значит и микробицидную) активность протеин-аргинин дезаминазы 4 (PAD4) и эластазы нейтрофилов (NE), а также миелопероксидазы (MPO). PAD4 и NE расщепляют основные ядерные гистоны. Отметим также, что комплекс NADPH-оксидаза способствует транслокации NE из цитозольных гранул в ядро, где она способствует расщеплению хроматина посредством расщепления гистонов.
Одновременно происходит патогенетически важный процесс при ИВРЗ, а именно – гиперцитруллинизация гистонов ферментом PAD4. Это приводит к деконденсации и мобилизации хроматина и, кроме этого, как указывалось выше, к индукции ауто-АГ, и, как следствие, дезорганизации рыхлой волокнистой соединительной ткани. Отметим, что активность фермента PAD4 отличает нетоз от апоптоза, поскольку индукция апоптоза предотвращает активацию PAD4 [151].
Важным свойством PAD4 является то, что во внеклеточной среде активация PAD4 может приводить к образованию цитруллинированных форм фибриногена, фибронектина, коллагена и других матриксных белков, которые, которые в этой ситуации могут выступать в качестве ауто-АГ при ИВРЗ [53].
Следующий этап суицидального нетоза состоит из MPO-зависимого распада оболочки ядра и смешивания ДНК с белками гранул внутри большой внутриклеточной вакуоли перед выдавливанием сеток из перфораций в плазмалемме с последующей гибелью Нф [125].
При суицидальном нетозе в дополнение к составу сети, указанному выше, в Нф определяется матриксная металлопротеиназа 9 (MMP-9), лизосомальный мембранный белок-2 (LAMP-2) и антибактериальный пептид, полученный из кателицидина, называемый LL-37. Активность этих белков способствует уничтожению некоторых микробов [176].
Отметим, что активация кальциевых и цинковых мембранных каналов способствует генерации АФК и цитруллинизации гистонов ферментом PAD4. Этому способствуют и процессы деградации внутриклеточных бактериальных, вирусных и простейших патогенов при аутофагии [65].
Вторая форма нетоза – витальный нетоз, возникает в ответ на патогенные микроорганизмы и представляет собой относительно быстрый процесс – от 5 до 60 минут. Эта форма нетоза характеризуется тем, что ядро теряет свою характерную дольчатую структуру. Мембрана ядра распадается, хроматин деконденсируется и попадает в цитоплазму, в то время как плазматическая мембрана остается неповрежденной. Затем, по истечении времени, плазмалемма разрывается, что приводит к высвобождению сети. Витальный нетоз зависит от АФК и активности NE [27, 125]. При этом обнаруживается интересное явление. Нф, лишённые ядра вследствие нетоза, сохраняют свою хемотаксическую способность, “преследуя и удерживая” бактерии, в частности, стафилококк [196]. Т. е. этот механизм щадит внешнюю мембрану Нф, тем самым позволяя Нф отчасти выполнять свои функции.
Витальный нетоз индуцируется через рецептор TLR2, а также компонентами активированной системы комплемента (C1q) после контакта с грамположительными бактериями. Активное участие при этом принимают и тромбоциты, которые посредством своего TLR4 рецептора взаимодействуют с ЛПС грамотрицательных бактерий и образуют агрегаты с нетозными Нф, благодаря своему прокоагулянтному эффекту.
Третья форма нетоза – митохондриальный нетоз. При этом определяется вытеснение митохондриальной ДНК из клеток без предварительной активации комплекса NADPH-оксидазы (Nox). Митохондриальный нетоз может быть индуцирован C5a-компонентом активированной системы комплемента, ЛПС или иммунными комплексами, включающими в себя рибонуклеопротеины [111]. Эта форма нетоза является следствием выработки АФК митохондриями. Подобные "митохондриальные сетки" обнаружены после операций, но также у пациентов с хроническим гранулематозным заболеванием и при СКВ [123].
В нетотически трансформированных Нф определяется интересное свойство – это способность ограничивать воспаление за счет деградации цитокинов и хемокинов [163].
Однако чрезмерный нетоз может привести к повреждению тканей, например, в легких. Патогенетическая значимость нетоза показана при сердечно-сосудистых заболеваниях, атеросклерозе, тромбофилии, эндотелиальной дисфункции, канцерогенезе, а также при аутоиммунных заболеваниях [117].
С момента открытия нетоза интерес к Нф, как к потенциальным активным участникам аутоиммунных заболеваний, существенно вырос. Этот интерес обусловлен тем, что, прежде всего, в количественном отношении эти клетки являются превалирующими среди всех ядросодержащих клеток крови. Эти клетки могут быть иммунологически активными и одновременно быть ауто-антигенными мишенями. Последние свойства Нф связаны с широкой вариабельностью качеств этих клеток в ходе иммунного ответа – от секреции цитокинов, продукции антибактериальных агентов и формирования нетоза до стимуляции адаптивного иммунитета.
Нетоз может способствовать индукции аутоиммунитета. Активированные Нф и сети обнаруживаются в высоких концентрациях в очагах воспаления при различных аутоиммунных заболеваниях. Нарушение процесса очищения от сетей, более высокая концентрация сетей или взаимодействие сетей с другими иммунными клетками могут сыграть важную роль в нарушении аутотолерантности.
Некоторые механизмы заключаются в следующем. Формирующиеся при нетозе сети включают в себя гистоны, последние, взаимодействуя с TLR2, TLR4 и инфламмасомой NLRP3, активируют каспазу-1 (центральный фермент инфламмасомы NLRP3), что приводит к высвобождению активного IL-1β и IL-18. В такой ситуации прослеживаются черты сходства продуктов нетоза с DAMP [79].
Кроме этого, известно, что нетоз активирует созревание Мф и ДК и они усиливают реакцию Т-клеток даже на неоптимальные стимулы [178].
Ферменты, высвобождаемые Нф при нетозе, могут изменять внеклеточные собственные белки, делая их более иммуногенными. Кроме этого, большинство ауто-АГ, высвобождаемых при нетозе, могут стать более иммуногенными благодаря посттрансляционным модификациям. Цитруллинированные гистоны более предпочтительно распознаются ауто-АТ по сравнению с немодифицированными, что зарегистрированно при СКВ, синдроме Фелти, РА [151].
Другие посттрансляционные модификации гистонов, в частности ацетилирование, также могут усиливать иммуностимулирующий потенциал нетоза [181].
Нетоз часто вызывается патогенами. Известно, что инфекции могут способствовать развитию аутовоспалительных и аутоиммунных заболеваний, в частности, из-за скопления бактерий и аутологичного ядерного хроматина. Эта смесь ДНК человека и бактерий может иметь значение при индуцировании аутоиммунного ответа против ДНК, поскольку бактериальная ДНК содержит гипометилированные CpG-мотивы, которые непосредственно стимулируют TLR рецепторы (TLR9) на В-клетках, Мф и ДК. В результате сети запускают выработку ауто-АТ В-клетками памяти, активируются плазмацитоидные дендритные клетки (пДК), которые являются основными продуцентами IFN I типа [151]. Подобная последовательность событий. способствует адаптивному иммунному ответу на собственные антигены. Нейтрофильные сети также могут инициировать апоптоз макрофагов через повреждение митохондрий.
Нф являются доминирующими в КВИ при системных васкулитах, в инфильтратах кожи при дерматомиозите, в синовиальном экссудате при РА и на границе паннус/хрящ, где происходит наибольшее повреждение тканей [30, 31, 132].
При СКВ в крови пациентов обнаруживаются повышенные уровни апоптотических, активированных и незрелых нейтрофилов, а процент апоптотических и активированных нейтрофилов положительно коррелирует с активностью заболевания [20].
Также нетоз может быть источником ауто-АГ при ИВРЗ. Нетотически трансформированные Нф могут служить подходящими мишенями для аутоантител. “Нейтрофильный аутоиммунитет”, идентифицируемый, в частности, по факту продукции анти-нейтрофильных цитоплазматических ауто-АТ (ANCA), связан с васкулитами мелких сосудов – микроскопическим полиангиитом, гранулематозом Вегенера, синдромом Черга-Стросса и узелковым полиартериитом [42, 113].
ANCA описаны при системной склеродермии (СС) и СКВ. Кроме этого, ANCA антитела к рибонуклеопротеину (RNP) стимулируют нетоз после обработки Нф провоспалительными цитокинами [86].
Патогенетическая связь между васкулитами и нетозом подтверждается данными о том, что активированные эндотелиоциты способны прямо стимулировать Нф к нетозу, которые, пребывая в этом состоянии, могут уже сами вызвать повреждение эндотелия [66].
Патогенетическое значение нетоза при СКВ подтверждено многочисленными данными. При этом заболевании сети обнаруживаются в коже и почечных клубочках, причём клиренс нетотических клеток существенно нарушен вследствие недостаточной фагоцитарной функции Мф. Это может привести к постоянному присутствию нейтрофильных ауто-АГ.
Аутоантитела, элюированные из биопсий при волчаночном нефрите человека, во всех случаях были специфичны к компонентам нетоза [24].
Кроме того, чрезмерное образование и недостаточное очищение от сетей приводят к повышению их остаточного уровня, обуславливающего более высокие концентрации в крови циркулирующей внеклеточной ДНК. Повышенные уровни внеклеточной ДНК патогенетически связаны с активностью волчаночного нефрита [198].
Нетотические сети обычно разрушаются циркулирующими нуклеазами, такими как ДНК-аза. Экспериментально показано, что сыворотка крови от пациентов СКВ нарушает этот процесс, способствуя тем самым накоплению сетей и пролонгации воспаления. Связывается этот эффект с наличием повышенных уровней антител, направленных против гистонов и ДНК, а также гипокомплементемии (C1q компонента) [103].
Весьма показательны результаты исследования NET-реактивности сывороток крови от больных СКВ.
Рис. 28. Иммунофлуоресцентный анализ NET-реактивности сыворотки крови от больных СКВ
Примечание. А – интактные нейтрофилы от здоровых доноров, обработанные сывороткой крови больных СКВ, В – ЛПС-индуцированный нетоз нейтрофилов здоровых доноров, также обработанных сывороткой крови больных СКВ, по материалам [53]
На рис. 28 представлены результаты иммунофлуоресцентного исследования NET-реактивности сыворотки крови больных СКВ, свидетельствующие о том, что нетоз при ИВРЗ может быть источником ауто-АГ. А – это интактные нейтрофилы, обработанные сывороткой крови от больных СКВ, В – нейтрофилы, у которых нетоз был индуцирован ЛПС и затем эти клетки были проинкубированы с сывороткой крови больных СКВ. На препаратах ДНК идентифицируется по голубому свечению, IgG от больных СКВ, связавшийся с нетотическими нейтрофилами красного цвета, плазмолемма нейтрофилов окрашена зелёным цветом.
Видно, что при ЛПС-индуцированном нетозе нейтрофилов от здоровых доноров ауто-АТ (IgG-фракция) от больных СКВ связываются со структурами нетотически изменённых нейтрофилов. Аналогичные данные были получены и при синдроме Фелти. Т, е. нетоз может быть потенциальным источником уникальных ауто-АГ при ИВРЗ, которые отсутствуют в нестимулированных нейтрофилах.
Идентифицирована подгруппа Нф низкой плотности, названная гранулоцитами низкой плотности (LDG). Эти клетки обладают повышенной склонностью к спонтанному нетозу, а также к гиперпродукции провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8, TNF), измененной фагоцитарной активностью, повышенной способностью синтезировать IFN I типа и цитотоксичностью по отношению к эндотелиальным клеткам [32].
При СКВ матриксные металлопротеиназы (ММП-2 и ММП-9), выделяемые LDG во время формирования сети, могут нарушать эндотелий-зависимую вазорелаксацию и индуцировать апоптоз эндотелиальных клеток [33].
Кроме того, нетотические Нф (LDG подгруппа) являются источником IFN I типа, имеющих крайне важное патогенетическое значение при ИВРЗ.
Нарушение клиренса компонентов нетоза в зародышевых центрах вторичных лимфоидных органов может привести к презентации ауто-АГ аутореактивным В-клеткам с последующей продукцией анти-нейтрофильных АТ. Наконец, появляется всё больше работ, свидетельствующих и значительной патогенетической роли митохондриального нетоза при СКВ. Основное значение в этом случае отводится продукции митохондриальных АФК, стимулирующих нетоз. Показана роль нетоза при ANCA-ассоциированных васкулитах (AAV), являющихся первичными системными некротизирующими васкулитами. У пациентов с AAV определяется повышенный уровень нетотически трансформированных Нф в кровообращении, такие же сети были идентифицированы и в образцах биопсии почечной ткани [86].
Эти сетевые структуры являются высокоиммуногенными и запускают адаптивные иммунные реакции, имеющие отношение к аутоиммунитету, приводящие к активации В-клеток и выработке аутоантител [161].
Как отмечалось выше Нф являются наиболее распространенными клетками в синовиальной жидкости и синовиальной оболочке пациентов с РА.
Усиленный нетоз наблюдался в циркулирующих Нф, а также в Нф синовиальной жидкости при РА по сравнению с Нф здоровых доноров и пациентов с остеоартритом. Кроме того, сетчатые Нф проникали в синовиальную ткань РА, ревматоидные узлы и кожу. Нетоз коррелировал с уровнями ауто-АТ (ACPA), а также с системными маркерами воспаления. В свою очередь, наличие ауто-АТ (ACPA и RF) при РА и продукция провоспалительных цитокинов может стимулировать Нф к нетозу.
При РА в процессе нетоза на Нф в синовиальной оболочке экспрессировались цитруллинированные ауто-АГ, стимулирующие продукцию таких ауто-АТ как ACPA [171].
Антитела к цитруллинированному виментину эффективно индуцировали образование сети. Более того, провоспалительные цитокины – IL-17 и TNF-α индуцировали нетоз в Нф больных РА. Одновременно нетоз значительно усиливал воспалительный ответ синовиальных фибробластов больных РА за счёт продукции IL-6, IL-8, хемокинов и молекул адгезии. Нф при РА экспрессируют высокие уровни PAD2 и PAD4 и накапливаются в синовиальной жидкости пациентов с РА во время обострения заболевания [87].
При РА определяется усиленный ЛПС-индуцированный нетоз, что отчётливо видно на рис. 29.
Рис. 29. Нетоз нейтрофилов периферической крови больных РА
Примечание. Нетоз индуцировался действием бактериального липополисахарида (ЛПС). Сети визуализировались при флуоресцентной микроскопии как структуры, содержащие эластазу нейтрофильных клеток (зеленый), а также содержащие соединение 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (синий). Ув. ×40, по материалам [87]
На представленных препаратах Нф периферической крови и синовиальной жидкости нетоз идентифицируется по зелёному свечению мембраны Нф, обусловленной наличием в ней эластазы нейтрофилов (NE). Справа представлен препарат Нф от больных РА. Отчётливо видно, что эти клетки демонстрируют значительно повышенную способность к образованию сети. Слева представлен препарат с контрольными Нф от здоровых людей, также стимулированными ЛПС. Видно, что в этом случае признаки нетоза практически отсутствуют. Более того, в этой же работе показано, что при РА признаки усиленного спонтанного нетоза наблюдались у нестимулированных Нф течение 1 часа после культивирования и продолжали увеличиваться в течение 2–3 часов. Также сетчатые нейтрофилы были обнаружены в виде инфильтрирующих клеток в синовиальной ткани, ревматических узелках и коже пациентов с РА. Иными словами, патогенетически процесс нетоза при РА встречается во всех очагах продуктивного воспаления (locus morbi). Также была обнаружена значительная корреляция между процентом сетчатых Нф и уровнями С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови, скоростью оседания эритроцитов (СОЭ), ACPA и IL-17, т. е. маркёрами системного воспаления. Однако, продолжительность заболевания, острота артрита по клиническим признакам, титры ревматоидного фактора (РФ) не коррелировали с нетозом [87].
Повышенные уровни нетоза определяются также у пациентов с дерматомиозитом, полимиозитом и ювенильным дерматомиозитом. Это подтверждается высоким содержанием LL37 в плазме и циркулирующими в крови свободной ДНК (cfDNA) и IL-8. Принципиально такая же картина определялась и при ювенильном идиопатическом артрите с системным началом [52].
Из представленных материалов видно, что такая форма запрограммированной и регулируемой гибели Нф, как нетоз, принимает активное патогенетическое участие при ИВРЗ. Несмотря на то, что остаётся ещё много нерешённых вопросов, касающихся нетотических внутриклеточных молекулярных процессов и их функционального предназначения, взаимосвязи продуктивного воспаления и нетоза, тем не менее, имеющиеся знания в этой области позволяют определить направления исследований, связанных с регуляцией этого процесса. С учётом значимости “нейтрофильного иммунитета“ в патогенезе ИВРЗ, можно предположить, что будущие исследования будут связаны в т. ч. с поиском средств и методов воздействия на нетоз, удовлетворяющих запросам клинической практики.