Марат Зиявдинович Саидов
Клеточные и молекулярные механизмы патогенеза иммуновоспалительных ревматических заболеваний
4.2. Функциональные особенности и виды DAMPs
Как упоминалось выше, модель С. А. Janeway, основывающаяся на конститутивной экспрессии PRR-рецепторов на клетках врождённой иммунной системы, взаимодействующих с высококонсервативными молекулярными структурами микроорганизмов – PAMPs и, как следствие, индуцирующих АГ-специфический адаптивный антиинфекционный иммунный ответ, по сути, сменила доминирующую до того времени модель дискриминации "я/не я" по F. M. Burnet (модель самораспознавания, или иммунного надзора).
Полли Матцингер, 1947 г.р. иммунолог французского происхождения, научный сотрудник Национального института здравоохранения в Бетесде, США, автор новаторской “теории опасности”
Однако оставалось множество нерешённых вопросов в сфере фундаментальной иммунологии, связанных, в частности, с реактивностью иммунной системы в отношении неинфекционных индукторов иммунного ответа и, прежде всего, продуктов любых форм гибели клеток и тканевой дезорганизации. Выход в 1994 г. публикации Polly Matzinger, названной “Tolerance, Danger, and the Extended Family” [71] коренным образом расширило представления о функциональном предназначении PRR-рецепторов, их роли в поддержании иммунного гомеостаза и участии системы иммунитета в патогенезе многих заболеваний, в частности, ИВРЗ. В цитируемой работе Polly Matzinger пишет: “это эссе представляет собой описание клеточной толерантности, основанной на представлении о том, что движущей силой иммунной системы является необходимость распознавать опасность и предотвращать разрушение”. Т. е. дискриминация "я/не я", по F. M. Burnet, заменяется на распознавание опасности клеточного разрушения.
Френк Макферлайн Бернет, (1899–1985), крупнейший иммунолог XX века, доктор медицины Мельбурнского университета, лауреат Нобелевской премии по медицине 1960 г., автор клонально-селекционной теории иммунитета
Более того, предложенная Polly Matzinger “теория опасности” отвергала основные положения “иммунного надзора” по F. M. Burnet, поскольку отводила участие реактивности системы иммунитета в область динамического тканевого гомеостаза. Ткани организма, по Polly Matzinger, являются значительной частью того, что стимулирует иммунный ответ. Повреждённые ткани также определяют иммунный ответ, соответствующий этой ткани.
“Я предложила модель опасности, пишет Polly Matzinger, которая предполагает, что иммунная система больше озабочена повреждением, чем чужеродностью, и приводится в действие сигналами тревоги от поврежденных тканей, а не распознаванием “не-я”. И далее: “поскольку клетки, умирающие в результате нормальных запрограммированных процессов, обычно очищаются до того, как они распадутся, в то время как клетки, которые умирают некротически, высвобождают свое содержимое и любой внутриклеточный продукт потенциально может быть сигналом опасности при высвобождении……Важной особенностью является то, что сигналы опасности/тревоги не должны подаваться здоровыми клетками или клетками, подвергающимися нормальной физиологической гибели.” [70].
В настоящее время эти “сигналы опасности/тревоги” обозначаются как DAMPs, стимулирующие иммунный ответ через PRR-рецепторы. Иными словами, наш организм способен отличать “здоровый” гомеостаз тканей или встречи с чужеродными “дружественными” микроорганизмами от потенциальной “опасности”, которая может исходить от патогенов и/или поврежденной ткани. DAMPs инициируют иммунную воспалительную реакцию, что позволяет АПК индуцировать адаптивный иммунный ответ.
PRR-рецепторы для эндогенных (DAMPs) и экзогенных инфекционных (PAMPs) сигналов могли эволюционировать одновременно. Известно, что эти рецепторы часто взаимодействуют с одними и теми же молекулами. Так, TLR4 является рецептором и для бактериального продукта липополисахарида (LPS) и для эндогенной молекулы клеточного стресса Hsp70, HMGB1, а также внеклеточных продуктов распада гиалуроновой кислоты. TLR2 связывает бактериальные липопротеины и Hsp60. TLR9 связывается с последовательностями CpG ДНК, которые обнаруживается на множестве клеток. Сенсоры нуклеиновых кислот – TLR7 и TLR9 могут активироваться как чужеродными, так и собственными нуклеиновыми кислотами [68].
Кроме того, NLRP3-инфламмасома индуцирует секрецию IL-1β в ответ на такие DAMP, как АТФ или мочевая кислота, эта же NLRP3-инфламмасома продуцирует IL-1β при инфицировании вирусами, грибами и бактериями [98].
Поскольку воспалительные реакции, инициируемые DAMPs, не зависят от патогенной инфекции, их называют “стерильным” воспалением [21].
На рис. 34 представлены иммунные и неиммунные клетки, участвующие в PRR-распознавании при “стерильном” воспалении с соответствующими патофизиологическими следствиями. Нарушения представленных на этой иллюстрации функциональных свойств этих клеток лежат в основе иммунопатогенеза ИВРЗ (более подробно см. ниже).
Рис. 34. Клетки, экспрессирующие PRR-рецепторы, взаимодействующие с DAMPs и участвующие в “стерильном” воспалении, по материалам [37]
Как видно из рис. 34 DAMPs, связанные с повреждением клеток при “стерильном” воспалении, инициируют системные аутовоспалительные и аутоиммунные процессы посредством активации различных типов клеток.
А. Моноциты/макрофаги, дендритные клетки (ДК), нейтрофилы, тучные клетки, естественные киллеры (NK) и эозинофилы – все они экспрессируют PRR-рецепторы. После взаимодействия с DAMPs, эти клетки могут высвобождать провоспалительные медиаторы, которые, в свою очередь, приводят к мобилизации воспалительных клеток и активации адаптивных иммунных реакций. Макрофаги, ДК и нейтрофилы являются профессиональными фагоцитами, которые способны презентировать Т-клеткам пептиды, полученные из DAMP. Активированные DAMPs NK-клетки и эозинофилы могут проявлять цитотоксические эффекты, приводящие к разрушению клеток-мишеней.
В. Несколько типов неиммунных клеток, таких как эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты, также экспрессируют PRR-рецепторы и могут быть активированы DAMPs. Активированные DAMPs эпителиальные клетки могут влиять на реакцию врожденных и адаптивных иммунных клеток посредством высвобождения цитокинов и хемокинов, а также посредством экспрессии MHC I и II класса и костимулирующих молекул. Во время “стерильного” воспаления эндотелиальные клетки могут способствовать привлечению иммунных клеток в поврежденную ткань посредством выработки провоспалительных цитокинов, экспрессии молекул адгезии и изменения проницаемости сосудов. Фибробласты могут регулировать функцию врожденных и адаптивных иммунных клеток посредством выработки провоспалительных цитокинов, хемокинов и факторов роста.
C. DAMPs также могут непосредственно стимулировать адаптивные иммунные клетки, регулируя их активацию, миграцию и дифференцировку.
Таким образом, подобно воспалению, вызванному инфекционными патогенами, DAMPs при “стерильном” воспалении могут активировать клетки врождённого иммунитета (нейтрофилы, макрофаги дендритные клетки) и неиммунные клетки (эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты). Активация этих клеток приводит к выработке различных цитокинов и хемокинов, которые, в свою очередь, мобилизуют воспалительные клетки и активируют адаптивные иммунные ответы. Кроме того, некоторые DAMPs также могут непосредственно активировать клетки адаптивной иммунной системы. Все указанные процессы являются патогенетически значимыми при ИВРЗ [92].
Общей особенностью DAMPs является то, что они являются эндогенными факторами, которые изолированы внутриклеточной средой и поэтому скрыты от распознавания иммунной системой в нормальных физиологических условиях. Однако при клеточном стрессе или повреждении клеток эти молекулы высвобождаются во внеклеточную среду и индуцируют неинфекционное “стерильное” воспаление. Форма гибели клеток влияет на их способность высвобождать иммуностимулирующие DAMPs и их иммуногенность. Так некроз обычно возникает в условиях сильного повреждения (например, ишемии или травмы), однако в таких условиях апоптоз не индуцируется. Важным следствием некротической гибели клеток является потеря целостности плазмалеммы, что позволяет внутриклеточному материалу выходить из клетки. К внутриклеточным DAMPs, полученных из некротических клеток, относят ассоциированный с хроматином высокомобильной негистоновый, ядерный белок группы box 1 (HMGB1), белки теплового шока (HSP), пуриновые метаболиты, такие как АТФ и мочевая кислота. Все перечисленные соединения обладают способностью взаимодействовать с TLR-рецепторами [16, 55, 88, 95].
Замечательной чертой этого взаимодействия является то, что несмотря на структурную гетерогенность DAMPs, они обладают общей способностью связывать и активировать одни и те же PRR-рецепторы, такие как, например, TLR2 и TLR4, для запуска иммунного ответа. Иммунная сигнализация, опосредованная TLR-DAMP взаимодействием, увеличивается за счет поверхностных молекул, в частности CD14 и CD36, с последующей активацией всех внутриклеточных сигнальных путей. В отличие от PAMPs, вышеуказанные DAMPs обладают уникальной способностью взаимодействовать с двумя TLR, часто с TLR2 и с TLR4, которые чувствительны как к грамположительным, так и к грамотрицательным патогенам. Аффинное связывание таких внеклеточных DAMPs, как бигликан и декорин (см. ниже) с TLR4 сопоставимо с взаимодействием этого же рецептора с LPS. Этот факт подчеркивает, насколько мощными индукторами воспаления являются DAMP, что подтверждается клинической картиной ИВРЗ.
Внеклеточные DAMPs
Внеклеточные DAMPs высвобождаются в результате деградации внеклеточного матрикса во время повреждения тканей, в частности, рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани. При этом такие фрагменты внеклеточного матрикса, такие как гиалуроновая кислота, гепарансульфат и бигликаны, образуются в результате протеолиза ферментами, высвобождаемыми из умирающих клеток, или протеазами, активируемыми в процессе регенерации и ремоделирования тканей [10, 96].
Внеклеточные, растворимые, DAMPs вовлекают множественные PRR-рецепторы, инициируя быструю воспалительную реакцию. Активированные IL-1α и IL-33 ДК и Мф начинают de novo синтез дополнительных растворимых DAMPs, пополняя тем самым пул внеклеточных DAMPs. Одновременно ряд молекул, которые в нормальных условиях являются изолированными компонентами экстрацеллюлярного матрикса, могут быть протеолитически высвобождены после повреждения ткани и затем действовать в своей растворимой форме в качестве DAMPs [97].
Молекулярный состав внеклеточных DAMPs довольно неоднороден, начиная от небольших молекул мочевой кислоты или АТФ до крупных белков размером более 100 кДа и даже органелл. В свою очередь, это большое структурное разнообразие позволяет DAMPs обеспечивать перекрестную реактивность между PRR-рецепторами и широким спектром “неиммунных” рецепторов, что, в конечном итоге, влияет на сложность передачи сигналов DAMP [35].
В табл. 1 представлены патогенетически значимые при ИВРЗ внеклеточные DAMPs и взаимодействующие с ними PRR-рецепторы.
Табл. 1. Внеклеточные DAMPS, механизм их высвобождения и взаимодействующие с ними PRR-рецепторы
Необходимо обратить внимание, что все представленные в табл.1 DAMPs входят в состав внеклеточного матрикса рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, т. е. того плацдарма, где развивается системный иммуновоспалительный процесс при ИВРЗ.
Протеогликаны (PGs) являются наиболее хорошо охарактеризованными DAMPs полученными из экстрацеллюлярного матрикса. В структуре PGs гликозаминогликановые боковые цепи способны взаимодействовать с различными PRR-рецепторами и управлять их перекрестной реактивностью. Активность матриксных металлопротеиназ MMP-2, MMP-3, MMP-13 и гранзима B обеспечивает высвобождение из экстрацеллюлярного матрикса протеогликанов, бигликанов, декорина, хондроитин/дерматансульфата выступающих при ИВРЗ в качестве лигандов для TLR2 и TLR4. Таким образом, экстрацеллюлярный матрикс при ИВРЗ служит источником DAMPs, на которые система врождённого иммунитета активно реагирует посредством PRR-рецепторов [79].
Внутриклеточные DAMPs
Помимо экстрацеллюлярных DAMPs существует обширная и разнородная группа внутриклеточных молекул опасности. Гибель клеток вследствие случайного некроза или в случаях регулируемых форм гибели клеток – аутофагии, апоптоза, некроптоза, пироптоза и нетоза сопровождается высвобождением эндогенных молекул из различных компартментов или органелл клеток, которые могут действовать как DAMPs. Эта группа DAMPs более обширна. В табл. 2 представлены основные внутриклеточные DAMPs, имеющие патогенетическое значение при ИВРЗ.
Табл. 2. Внутриклеточные DAMPS, механизм их высвобождения из клетки и взаимодействующие с ними PRR-рецепторы
Как видно из табл.2 внутриклеточные DAMPs включают в себя биоорганические соединения цитозоля, ядра, клеточных мембран и органелл, обеспечивающих базисные основы жизнедеятельности клетки и высвобождающиеся при её повреждении. Представленные соединения по химическому составу и по функциональным особенностям отличаются от внеклеточных DAMPs. Спектр реагирующих на них PRR-рецепторов более широкий. Помимо “традиционных“ TLR2 и TLR4 он включает в себя TLR9, RAGE-рецептор, IL-1R, молекулы LRP3, CD91, а также цитозольный NLR-рецептор – NLRP3, участвующий в формировании провоспалительной NLRP3-инфламмасомы. Увеличение количества реактогенных PRR-рецепторов и перечня внутриклеточных DAMPs означает расширение патофизиологических следствий PRR-DAMP взаимодействий при ИВРЗ на этапах воспалительного процесса, связанных с разрушением клеток.
С учётом активного участия внутриклеточных DAMPs в патогенезе ИВРЗ, ниже представлены их основные характеристики.
Митохондриальные DAMPs. В процессе некроза клеток, а также в процессах регулируемой клеточной гибели – аутофагии, апоптоза, некроптоза, пироптоза и нетоза митохондрии являются основными органеллами, которые выделяют различные DAMPs (см. табл. 2 и рис. 1). Более того, митохондрии являются единственными органеллами, которые сами по себе действуют как DAMP после высвобождения во время некроптоза. Митохондрии, выделившиеся из некротических клеток, фагоцитируются макрофагами и индуцируют выработку провоспалительных цитокинов – IFN I типа, IL-1β, TNF-α [66].
При нарушении целостности митохондрии могут высвобождать в кровоток различные внутримитохондриальные компоненты, такие как мтДНК, мтРНК, формилированные пептиды, АТФ и цитохром-с, которые распознаются упомянутыми выше PRR-рецепторами, обеспечивая PRR-DAMP взаимодействие [126]. мтДНК также опосредует воспалительные реакции во внутриклеточном пространстве посредством активации инфламмасом. В этих процессах принимают участие NLRP3 и AIM2 инфламмасомы, вовлечённые во взаимодействие с мтДНК [39].
Ядерные DAMPs. Транслокация различных ядерных молекул, таких как HMGB1, гистоны или ДНК, является еще одним механизмом формирования внутриклеточных DAMPs во время воспаления или гибели клеток. HMGB1 представляет собой высокомобильный ядерный негистоновый ДНК-связывающий белок, который также может транслоцироваться в цитоплазму и затем высвобождаться внеклеточно посредством везикулярного экзоцитоза [87].
HMGB1 может продуцироваться не только активированными моноцитами и макрофагами, но также некротическими или поврежденными фибробластами пассивным способом или при апоптозе [95].
HMGB1 также обнаружен в микрочастицах, полученных из апоптотических клеток HeLa и Jurkat [14].
HMGB-1 взаимодействует с TLR2 и TLR4 рецепторами, а также с рецептором для конечных продуктов расширенного гликирования – RAGE рецептором. При РА наблюдается увеличение синовиальных макрофагов в синовиальной ткани, экспрессирующих TLR2 и TLR4 [45].
Интересно, что гипоксия, присутствующая в воспалённых суставах при РА, вызывает внеклеточное высвобождение HMGB-1, которое было гораздо более заметным, чем высвобождение просто в результате некроза клеток [42].
Уровни HMGB-1 в сыворотке крови у пациентов с РА коррелируют с активностью заболевания. Показано, что провоспалительный цитокин – TNF-α способствует транслокации HMGB-1 из ядра в цитоплазму. Также было показано, что HMBG-1 способствует ангиогенезу, что облегчает попадание лимфоцитов в воспалённый сустав.
При СКВ ДНК-хроматиновые комплексы содержат HMGB-1, который необходим для активации ДК и В-клеток посредством TLR9-зависимой передачи сигналов и с последующей продукцией INF I типа [108].
Гистоны – это ядерные белки, которые, участвующие в образовании хроматина и хромосом на основе двухцепочечной ДНК. Высвобождающиеся при воспалении, а также в процессах нетоза, апоптоза и некроза гистоны выступают в качестве патогенетически значимых при ИВРЗ внутриклеточных DAMPs [121].
Цитозольные DAMPs. К ним относится мочевая кислота, которая является одним из основных эндогенных DAMPs. Она конститутивно присутствует во всех клетках, но её уровни повышаются после повреждения клеток [55].
Это конечный продукт распада пуриновых нуклеотидов. Погибающие клетки выделяют внеклеточно мочевую кислоту, которая затем способна вызывать иммунные реакции, такие как индукция созревания ДК и усиление цитотоксической активности CD8+ Т-клеток, что является патогенетически значимым при подагре.
Ca2+– связывающие белки S100A8 и S100A9 широко вовлечены в индукцию воспаления и фиброза. Они действуют как DAMPs после высвобождения из фагоцитов, реагирующих на клеточный стресс. Показано, что эти белки высвобождаются моноцитами человека после активации протеинкиназы C [32].
Белки теплового шока (HSP) представляют собой класс белков, которые обычно играют роль шаперонов и помогают биосинтетическому механизму в правильном сворачивании белков. Однако HSP могут также действовать как DAMPs, взаимодействуя с TLR рецепторами после высвобождения из внутриклеточного пространства. HSP обычно высвобождаются из погибающих клеток после апоптоза, некроза, а также при клеточном стрессе (рис. 1) [115].
Рецептор для конечных продуктов расширенного гликирования (RAGE). Одним из наиболее хорошо изученных рецепторов DAMPs является RAGE. Этот рецептор не относится к группе PRR-рецепторов. Он имеет три части: внеклеточную часть, которая отвечает за взаимодействие с лигандом через свой V-домен, трансмембранный домен для прикрепления белка к поверхности клетки и цитоплазматический домен, который отвечает за нисходящую внутриклеточную сигнализацию. RAGE также может существовать в усеченных формах после альтернативного сплайсинга или обработки протеазой. В отсутствие своего V-домена он не может связывать лиганды, тогда как в отсутствие трансмембранного домена он становится растворимым и может связывать лиганды, действуя как рецептор-приманка, предотвращая их связывание и активируя зрелый RAGE. RAGE изначально был идентифицирован как рецептор для конечных продуктов расширенного гликирования (AGEs). Однако позже было показано, что он служит рецептором для ряда DAMPs, включая HMGB, белки S100 и белок, связанный с амилоидом. Важной особенностью RAGE является то, что, несмотря на структурное разнообразие лигандов RAGE, его активация приводит к общему пути: активации транскрипционного фактора NF-κB, продукции TGF-α и пролиферации клеток. Помимо клеток системы иммунитета этот рецептор экспрессируется на альвеолоцитах, миоцитах, эндотелиоцитах, эмбриональных клетках, клетках глии [4, 65].
Сывороточный амилоид А (SAA) представляет собой белок острой фазы воспаления, продуцируемый гепатоцитами. SAA причислен к DAMP на основании того, что он связывает TLR2 и индуцирует воспалительные сигналы [24].
Отметим, что фибробласты кожи пациентов с системной склеродермией (СС) имели более высокие уровни TLR2 по сравнению со здоровыми контрольными фибробластами кожи и были более чувствительны к SAA. Иными словами, SAA является патогенетически важной молекулой при СС вследствие TLR-2 опосредованной индукции провоспалительных цитокинов. Уровень SAA также повышен при РА. Показано, что он индуцирует протеолитические ферменты в синовиальных фибробластах РА, которые опосредуют разрушение сустава и усиливают эффекты миграции клеток, облегчаемые поверхностными интегринами. Кроме этого SAA индуцирует мобилизацию лейкоцитов в очаг воспаления и стимулирует ангиогенез [26].
Высвобождение DAMPs, связанное с аутофагией, пироптозом и некроптозом
При регулируемой гибели клеток могут высвобождаться различные DAMPs. В частности, показано опосредованной аутофагией высвобождение HMGB1, АТФ, IL-1β и ДНК, при этом HMGB1 локализуется в аутофагосомах до его высвобождения из клеток (табл. 2 и рис. 1). Эпителиальные клетки, подвергшиеся пироптозу также высвобождают HMGB1. При некроптозе и аутофагии АТФ высвобождается из клеток, активирует провоспалительную инфламмасому NLRP3, что приводит к поглощению умерших клеток макрофагами [8].
IL-1β представляет собой DAMP, который может активно секретироваться клетками в ответ либо на PAMPs, либо на другие DAMPs, но он также может пассивно высвобождаться клетками, подвергшихся некрозу или пироптозу (41). Заметим, что аутофагия является фактором, могущим также и ограничить высвобождение IL-1β [125].
На рис. 35 представлена наглядная иллюстрация динамики внутриклеточных и внеклеточных DAMPs, имеющих патогенетическое значение при ИВРЗ
Рис. 35. Модель PRR-DAMPs взаимодействий, в которой источником вне- и внутриклеточных DAMPs являются экстрацеллюлярный матрикс рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, цитозоль, плазмалемма и клеточные органеллы, по материалам [96].
На рис. 35 представлена модель, согласно которой вне- и внутриклеточные DAMPs активируют TLR- и NLR-рецепторы, причём последние формируют провоспалительную NLRP3-инфламмасому. После регулируемой гибели клетки или после клеточного некроза различные внутриклеточные DAMP высвобождаются из митохондрий, аутофагосом, ядра и цитозоля. В свою очередь, HMGB1, гистоны, HSP и белки S100 взаимодействуют с TLR-рецепторами клеточной поверхности. мтДНК активирует внутриклеточные TLR-рецепторы после эндоцитоза. Кроме того, гистоны и мочевая кислота активируют NLRP3-инфламмасому после фагоцитоза, тогда как АТФ активирует инфламмасому P2X7-зависимым образом. Кроме этого, при повреждении ткани высвобождаются внеклеточные DAMPs, вследствие активности различных протеиназ (в основном, ММР). Таким образом, такие компоненты внеклеточного матрикса как SLRPs (бигликаны, декорин), гиалуронан (HA) и гепаран сульфат (HS) обеспечивают взаимодействие TLR-рецепторов клеточной поверхности с указанными DAMPs. Кроме того, бигликан может активировать инфламмасому через рецептор P2X7. Однако, HA интернализуется CD44-зависимым образом и после фрагментации на HA-олигосахариды активирует NLRP3- инфламмасому.
Необходимо ещё раз отметить, что все указанные DAMPs являются продуктами дезорганизации рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани и регулируемой клеточной гибели при ИВРЗ. Эти продукты приобретают все характеристики ауто-АГ, активирующие провоспалительные механизмы врождённого и адаптивного иммунитета, являющиеся патогенетическим базисом ИВРЗ.