Марат Зиявдинович Саидов
Клеточные и молекулярные механизмы патогенеза иммуновоспалительных ревматических заболеваний
C использованием проточной цитометрии, показано, что апоптотические гранулоциты были статистически значимо выше у пациентов с РА по сравнению с контрольной группой. Причём это повышение сочеталось с увеличением уровня некротических гранулоцитов и моноцитов. На основании полученных данных авторы делают вывод о том, что нейтрофилы и моноциты при РА подвергаются апоптотическим модификациям, которые сопровождаются вторичным некрозом (см. выше) этих клеток при РА. Подобные сдвиги могут привести к накоплению ауто-АГ, что приводит к прогрессированию РА [95].
Получены интересные результаты, касающиеся патогенетического участия апоптоза при синдроме Шегрена. Показано, что при этом заболевании в биоптатах слюнных желёз повышена экспрессия связанного с лизосомами мембранного белка 3, обозначаемого как LAMP3/CD208/DC-LAMP. Экспрессия LAMP3 индуцирует дисфункцию эпителиальных клеток, приводящую к их апоптозу. Причём эта дисфункция сопровождалась статистически значимым увеличением сывороточных аутоантител, таких как анти-Ro/SSA, анти-La/SSB и антиядерных антител. Соответственно, делается вывод о том, что при болезни Шегрена LAMP3 инициирует апоптоз, а также независимый путь внеклеточного высвобождения известных ауто-АГ, приводящий к образованию аутоантител, связанных с этим заболеванием. Кроме этого, определяется перекрест молекулярных сигнальных путей между LAMP3-индуцированным апоптозом и аутофагией при синдроме Шегрена [175].
Патогенетическое значение апоптоза изучено и при полимиозитах. В частности, показано, что при этих заболеваниях в присутствие IFN I типа апоптотические миоциты вызывают выработку ауто-АТ, лимфоцитарную инфильтрацию in situ и непрерывные циклы повреждения и регенерации мышц. Нарушение апоптоза миоцитов при аутоиммунных полимиозитах, недостаточная элиминация апоптотического материала Мф вызывает “неадаптивное ремоделирование” мышц с накоплением коллагена и жира и аутоиммунного ответа на ауто-АГ мышечной ткани [166].
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о неоспоримом патогенетическом значении апоптоза в КВИ при ИВРЗ. Следует обратить внимание, прежде всего, на противовоспалительные свойства апоптоза, а также на то, что апоптоз является формой гибели клеток, индуцирующей иммунную толерантность в т. ч. и к ауто-АГ. Накоплен большой материал, свидетельствующий о том, что регуляция указанных аспектов апоптоза, в частности, сигнальных путей, является одним из перспективных направлений молекулярной иммунотропной терапии ИВРЗ.
2.3. Некроптоз и ассоциированные с повреждением молекулярные паттерны (DAMPs)
Некроз, относящийся к основным категориям патоморфологии, является формой неконтролируемой гибели клеток, завершающейся аутолизом последних. Некроз является следствием воздействия экстремальных факторов, к числу которых, в частности, относятся инфекции, ишемия тканей, ионизирующая радиация, тепло, осмотический шок, механический стресс, замораживание-оттаивание и др. Отметим, что воздействие указанных факторов индуцируют случайную, неконтролируемую гибель клеток. Стадии некроза, а именно: паранекроз, некробиоз и аутолиз, отражают последовательность внутриклеточных процессов, приводящих, в конечном итоге, к набуханию органелл, увеличению объёма клеток, разрушению плазмалеммы, а также клеточного ядра (кариопикноз, кариорексис, кариолизис). Из основных морфологических вариантов некроза (колликвационный, коагуляционный, казеозный и фибриноидный) преобладающим при ИВРЗ является фибриноидный некроз клеток и тканей. Потеря целостности мембраны и высвобождение внутриклеточного содержимого придают некротическим клеткам способность вызывать неинфекционную воспалительную реакцию [22].
Детальное изучение молекулярных внутриклеточных процессов при некрозе показало, что в клетках существует множество сигнальных каскадов с участием адапторных молекул и последующей активацией транскрипционных факторов, напоминающих программу гибели клеток, которые дают основания для выделения определённых форм регулируемого некроза. К их числу относится наиболее часто упоминаемый некроптоз. Некроптоз – это генетически контролируемый процесс гибели клеток, характеризующийся грануляцией цитоплазмы, набуханием органелл, разрывом плазмалеммы. Эти признаки присущи и другим формам гибели клеток (этоз, нетоз, пиронекроз, пироптоз). Однако идентификация сигнальных путей, адапторных молекул и активации транскрипционных факторов, свойственных только некроптозу, позволило выделить этот процесс в качестве автономной формы клеточной гибели. При некроптозе отсутствуют такие маркеры апоптоза, как активация каспаз и конденсация хроматина и такие маркеры пироптоза, как активация провоспалительной каспазы-1. Некроптоз широко встречается при ишемических травмах головного мозга, при инфаркте миокарда, при гибели клеток, индуцированной химиотерапией опухолей, при окислительном клеточном стрессе.
Некроптоз представлен и в клетках воспалительного инфильтрата при ИВРЗ. Приятно отметить, что впервые понятие некроптоз ввёл в научный обиход наш соотечественник А. Дегтярёв [44].
Приведём примеры некоторых признаков некроптоза, рис. 19. В работе Berghe T. V. с соавт. [21] была использована клеточная линия мышиной фибросаркомы L929sAhFas, чувствительная к индукторам некроптоза – TNF и Н2О2. В данном эксперименте основным фактором некроптотического поражения клеток была генерация активных форм кислорода и эта генерация совпадала с началом появления типичных признаков некроптоза. Методом фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии авторы показали, что оба стимула вызывали округление клетки, за которым следовало набухание клеток и грануляция цитоплазмы. Затем наблюдался разрыв плазматической мембраны, которая приобретала раздутый «баллонный» вид. Эти процессы сопровождались повреждением митохондрий и лизосом. Как при TNF-, так и при Н2О2-индуцированной гибели клеток активность каспаз не обнаруживалась, в отличие от Fas-индуцированного апоптоза.
Рис. 19. Картина некроптоза на клеточной линии мышиной фибросаркомы L929sAhFas, полученная методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии
Примечание. Верхний ряд – TNF-индуцированный некроптоз, нижний ряд – Н2О2-индуцированный некроптоз. И том, и другом случаях наблюдается округление и набухание клеток, грануляция цитоплазмы с раздутым «баллонным» видом. Зелёная флуоресценция – свидетельство продукции активных форм О2, синяя флуоресценция – свидетельство разрывов плазматической мембраны, сопровождающиеся нарушением её проницаемости, по материалам [21]
Как указывалось выше, некроптоз встречается и при ИВРЗ. Воспаление при ИВРЗ является преимущественно продуктивным, сопровождающимся появлением эндогенных сигналов опасности, называемых “ассоциированные с повреждением молекулярные паттерны”, или DAMPs. Отличительной особенностью DAMPs является их способность взаимодействовать с рецепторами врождённого иммунитета (TLR-2, – 4, – 7, – 9), экспрессирующихся на фолликулярных и плазмацитоидных дендритных клетках (пДК и фДК) и активировать их [155].
DAMPs способны взаимодействовать и с другими PRR рецепторами на клетках в составе КВИ (NRL, RLR), тем самым, принимая активное участие в неинфекционном воспалении [36].
В DAMPs включают, в случаях неконтролируемого некроза, HMGB1, IL-1α, мочевую кислоту, фрагменты ДНК, белки теплового шока (HSP70, HSP90), содержимое митохондрий, АТФ и др. [54, 87].
Номенклатура DAMPs весьма противоречива. В целом, эти молекулы, в физиологических условиях локализующиеся внутриклеточно, могут быть разделены на две группы. Во-первых, это молекулы, которые выполняют невоспалительные функции в клетках и приобретают иммуномодулирующие свойства при их высвобождении во время повреждения клеток или клеточного стресса, например, такие как HMGB1 и АТФ. HMGB1 – это высокомобильный, негистоновый, ядерный групповой белок 1, освобождающийся из клеток, подвергшихся инфекционному повреждению, некрозу, некробиозу, клеточному стрессу. И во-вторых, это алармины т. е. молекулы, которые обладают цитокиноподобными функциями, которые высвобождаться при лизисе клеток и способствуют воспалительной реакции. К ним можно отнести, в частности, IL-1α и IL-33 [142, 158].
DAMPs высвобождаются и при дезорганизации рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани при ИВРЗ, приобретая при этом иммуногенные свойства.
Необходимо иметь в виду, что рецепторы врождённого иммунитета (TLR, NLR, RLR), экспрессирующиеся на дендритных клетках (ДК) и на клетках макрофагально-моноцитарного ряда в составе КВИ при ИВРЗ способны взаимодействовать как с DAMP, так и с молекулярными паттернами, связанными с инфекционными патогенами – PAMP. Факт весьма примечательный, указывающий на сходство между реакциями, вызванными инфекционными патогенами, и воспалительными реакциями на стресс, повреждение или смерть клеток [78].
Подобный взаимный перекрест сигнализации DAMP и PAMP является важным патогенетическим звеном при ИВРЗ. Известно, что инфекциям, прежде всего вирусам, отводится роль триггеров ИВРЗ. В процессе эволюции взаимодействие вирусов и эукариотических клеток привело к отбору генов, которые способствуют гибели инфицированных клеток в т. ч. путём некроптоза и апоптоза. Таким образом блокируется размножение и распространение вирусов в инфицированной клетке и в организме в целом. Однако в процессе той же эволюции выработались адаптивные вирусные механизмы, позволяющие им предотвратить гибель инфицированных клеток хозяина, тем самым, позволяя вирусам неограниченно реплицироваться. К таким механизмам относят формирование специфических ингибиторов каспазы 8, таких как модификатор цитокинового ответа A (CrmA), вирусный ингибитор активации каспазы (v-ICA) и вирусные FLICE-подобные ингибирующие белки (FLIPs) [131].
Ингибиция активности каспазы 8 предотвращает инициирование апоптоза и в то же время является ключевым условием индукции некроптоза. Это послужило поводом для заключения, что в данной ситуации некроптоз выполняет защитные функции “двери-ловушки”, которая открывается, когда каспаза-8 ингибируется и на этом фоне запускается процесс некроптоза с последующей гибелью клеток хозяина, а также вирусов, находящихся в ней.
Показано, что вирусная инфекция может сопровождаться выделением таких DAMP как Hsp70 и HMGB1, которые прямо взаимодействуют с молекулой – передатчиком сигналов CD24 и лектином Siglec-G/10 (ось CD24-SiglecG/ 10), экспрессирующихся на клетках макрофагально-моноцирарного ряда и дендритных клетках в составе КВИ при ИВРЗ. И таким образом формируется взаимный перекрест DAMP и PAMP определяющий, будут ли TLR и/или NLR, связанные с CD24 и экспрессирующиеся на вышеуказанных клетках, вызывать воспаление при воздействии DAMP [35].
В конце 80-х годов прошлого столетия было начато изучение так называемых рецепторно-взаимодействующих серин/треониновых киназ 1 и 3 (RIPK1 и RIPK3, соответственно), которые являются ключевыми киназами при некроптозе клеток, индуцированном TNF [100]. Затем был выявлен целый ряд индукторов некроптоза (более десятка) и молекулярные пути реализации этого процесса. К их числу относятся члены семейства фактора некроза опухоли (TNF), TLR рецепторов (TLR3, TLR4) производные ДНК и РНК, RLR рецепторов (RIG-1). [37, 197].
Таким образом, были представлены доказательства того, что есть формы некроза, которые контролируются генетически, зависят от активности RIPK1 и/или RIPK3, не зависят от активности каспаз, что и привело к появлению термина “некроптоз” для определения регулируемого некроза [61].
Характерной чертой некроптоза является то, что активность киназ RIPK1 и/или RIPK3 может ингибироваться молекулой, называемой некростатином 1 (NEC 1) [42].
В случае, когда некроптоз индуцируется провоспалительным цитокином TNF, задействованные сигнальные пути приводят к ингибированию каспазы 8 с последующим ауто- и трансфосфорилированием киназ RIPK1 и RIPK3, а также MLKL. Этот процесс, в конечном счёте, приводит к их агрегации в микрофиламентоподобные (амилоидоподобные) комплексы, которые называются некросомами. Некросомы являются маркерами некроптоза, и их наличие свидетельствует об усилении этого процесса [105].
Некросомы по своей молекулярной природе разнородны и, в зависимости от молекулярного состава, выделяют следующие их производные – это “комплекс I", содержащий молекулы TRADD, TRAF2/5, RIPK1, IAPs и LUBAC. Этот комплекс, после убиквитирования, инициирует активацию транскрипционного фактора NF-kB, и остается связанным с рецептором TNFR1. В случае, когда рецептор TNFR1 подвергается эндосомальной интернализации, этот процесс сопровождается высвобождением рецептор-ассоциированного комплекса из TNFR1 и образованию предшественника каспазы 8 – прокаспазы 8, что приводит к образованию “комплекса II”. Прокаспаза 8, подвергаясь процессу ограниченного протеолиза, трансформируется в активную каспазу 8. Комплекс II бывает двух типов – это комплекс IIa, который может вызвать апоптоз, за счёт активации каспазы 8, и комплекс IIb, также называемый некросомой, инициирующий некроптоз вследствие ингибирования каспазы 8 и фосфорилирования киназ RIPK1 и RIPK3 [145, 197].
Необходимо упомянуть ещё о двух белках, взаимодействующих и регулирующих активность киназ RIPK1 и RIPK3. Это смешанная киназа, подобная белку (MLKL), и митохондриальная фосфатаза 5 (PGAM5). Фосфорилирование MLKL наделяет эту молекулу способностью перемещаться к плазматической мембране и нарушать ее целостность [199].
Таким образом, ключевыми молекулярными событиями индукции некроптоза является индукция процессов фосфорилирования киназ RIPK1, RIPK3 и MLKL и негативная регулирование активности каспазы 8. Однако уникального биохимического маркера некроптоза не существует.
Разумеется, описанные молекулярные события являются сжатой картиной детально изученных молекулярных и межмолекулярных процессов, имеющих место в КВИ при ИВРЗ. Эта картина представлена на рис. 20. Она отражает положение дел в этой области на период десятых-двадцатых годов нашего столетия. Исследования в этой области продолжаются.
Рис. 20. Молекулярные механизмы некроптоза
Примечание. Некроптоз критически зависит от взаимодействующей с TLR-, TNF-, IFN-рецепторами серин-треониновой протеинкиназы 1 и 3 (RIPK1 и RIPK3). Для некроптоза также важно фосфорилирование киназы смешанного происхождения (MLKL), приводящего к олигомеризации MLKL, транслокации этой молекулы во внутреннюю часть плазматической мембраны, нарушению её целостности и гибели клеток. Образование некросомы, содержащего RIPK3 и MLKL, которая ускоряет некроптоз, может быть вызвано внеклеточными сигналами (например, связывание с рецептором смерти TNFR1), а также внутриклеточными сигналами (такими как присутствие вирусных нуклеиновых кислот) и регулируется сложной сетью функциональных белок-белковых взаимодействий.
Сокращения: dsDNA – двухцепочечная ДНК; dsRNA – двухцепочечная РНК; IFN – интерферон; IFNAR1 – рецептор интерферона (α и β)1; IFNG, γ-интерферон; IFNGR1- γ-рецептор интерферона; LPS – липополисахарид; P – фосфат; PIP – фосфатидилинозитол фосфат; TLR – Toll-подобный рецептор; TNF – фактор некроза опухоли; TNFR1 – рецептор 1 к TNF; TRIF – молекула-адаптер Toll-подобного рецептора 1; ZBP1- Z-ДНК-связывающий белок 1; по материалам [60]
Некроптоз присутствует при многих заболеваниях внутренних органов и систем, в т. ч. и аутоиммунных. Знание ключевых этапов этих процессов при некроптозе определяет стратегию разработки препаратов молекулярной таргетной терапии, в частности, при ИВРЗ [88].
Важно, что активность киназы RIPK1 регулирует высвобождение цитокинов и аларминов в некроптотических клетках, в частности, провоспалительного цитокина TNFα [38].
Также было показано, что при потере целостности плазмолеммы, некроптотический материал, находящийся во внеклеточной жидкости, подвергается процессу макропиноцитоза АПК [97]. Факт важный, поскольку при ИВРЗ процессинг некроптотических DAMP в АПК способствует презентации ауто-АГ в составе алеллей МНС I и II классов и индукции аутоиммунного ответа. Однако специфических DAMP, свойственных только некроптозу, не выявлено. Важно, что некроптоз, обусловленный RIPK3, способствует элиминации активированных Т-лимфоцитов, которые подверглись клональной экспансии в ответ на стимуляцию (инфекции, ауто-АГ), что имеет важное значение для поддержания гомеостаза Т-клеток, поскольку его нарушение может привести к иммунодефициту или аутоиммунитету.
К механизмам контроля некроптоза причисляют и аутофагию. Показано, что пролиферация Т – лимфоцитов нарушается в отсутствие генов аутофагии ATG5, ATG7, ATG3 или Беклина-1. Было высказано предположение, что киназа RIPK1 является связующим звеном между гибелью некроптотических клеток и аутофагией в активированных Т – клетках [69].
Показано, что некроптоз может быть вовлечен в патогенез и развитие СКВ, поскольку маркеры некроптоза определялись в В-клетках у пациентов с СКВ [56].
Открытие того, что конститутивная передача сигналов IFNγ способствует устойчивой экспрессии MLKL (смешанная киназа, подобная белку, регулирующая активность киназ RIPK1 и RIPK3, см. выше) и инициации некроптоза, подтверждает взгляд о том, что повышенная передача сигналов IFNγ при СКВ усиливает некроптоз, вызывая повреждение тканей
[162].
Как упоминалось выше, некроптоз может способствовать воспалительным реакциям за счет высвобождения DAMP. Эти результаты могут дать определенные доказательства роли некроптоза в патогенезе и развитии СКВ. Кроме этого, следующие результаты указывают на важное патогенетическое значение провоспалительных свойств некроптоза при ИВРЗ. Показано, что некроптотическая сигнализация может индуцировать активацию воспалительной системы NLRP3 и, взаимосвязанный с этой системой – пироптоз, что еще больше усиливает воспалительную реакцию. NLRP3 (или криопирин) – это цитозольный NLR рецептор, взаимодействующий с DAMP и/или PAMP, вовлечённый в активацию каспаз 1 и 5 с последующим образованием активных форм провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18. NLRP3 экспрессируется клетками макрофагально-моноцитарного ряда и является основным компонентом воспалительных NLRP3-инфламмасом, формирующихся в указанных клетках в условиях продуктивного воспаления при ИВРЗ. Киназа RIPK3, необходимая для некроптоза, также способствует формированию воспалительных NLRP3-инфламмасом [101, 192].
Активацию воспалительных NLRP3-инфламмасом аналогичным образом индуцирует и MLKL, что также приводит к высвобождению IL-1β [67].
К такому же эффекту приводит и высобождающийся некроптотическими клетками АТФ, который, после связывания с рецептором P2X7, активирует инфламмасому NLRP3 и генерирует зрелый IL-1β [170].
Митохондрии, высвобождаемые клетками в составе КВИ, подвергающихся некроптозу, индуцированному TNF-α, могут быть поглощены макрофагами и дендритными клетками человека, что приводит к секреции вышеуказанных провоспалительных цитокинов макрофагами и индуцировать АГ-презентирующую функцию дендритных клеток [115].
При инфекционном воспалении показано, что интерфероны I типа могут способствовать сборке киназ RIPK1 и RIPK3, вызывая некроптоз макрофагов и высвобождение провоспалительных медиаторов (включая IL-1α, IL-1β и IFN-γ [157].
Представленные внутриклеточные молекулярные процессы присутствуют в эктопических лимфоидных структурах (ELS), в ГЗТ-гранулёмах, а также в диффузном клеточном инфильтрате при ревматической лихорадке (РЛ), ревматоидном артрите (РА), системной красной волчанке (СКВ), дермато-полимиозите (ПМ).
Изучение экспрессии маркеров некроптоза и пироптоза методом количественной real time-PCR при экспериментальной СКВ показало, что экспрессия MLKL, GPX4 и PARP1 значительно повышалась в селезенке по мере прогрессирования заболевания, а CASP1, RIPK1, RIPK3 и CYPD были выше на ранних стадиях, но значительно снижались на более поздних стадиях. Напротив, в почках экспрессия генов, участвующих в пироптозе, например NLRP3 и CASP1, была значительно увеличена, а TNFR1, RIPK1, RIPK3 (маркеры некроптоза), CIAP1/2 и GPX4 были значительно снижены по мере прогрессирования волчаночного нефрита. Таким образом было показана органная специфика экспрессии маркеров регулируемого некроза, зависящая также и от стадии заболевания [72].
Резюмируя вышесказанное можно заключить, что принципиальное патогенетическое значение некроптоза при ИВРЗ заключается в том, что высвобождающиеся при дезорганизации рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани DAMPы, взаимодействуя с NLR-, TNF-, IFN-рецепторами клеток-мишеней активируют (путём фосфорилирования) киназы RIPK1, RIPK3 и MLKL. Транслокация молекулярных комплексов с участием указанных молекул во внутреннюю часть плазматической мембраны, вызывает нарушение её целостности и гибель клеток, т. е. возникает некроптоз. Эти процессы сопровождаются комплексной воспалительной реакцией in situ в паренхиматозных органах, в суставной щели, мышцах, коже, подкожной клетчатки, хрящевой ткани и др.