Марат Зиявдинович Саидов
Клеточные и молекулярные механизмы патогенеза иммуновоспалительных ревматических заболеваний
1.6. Ангиогенез и эндотелиальная реакция
В комплексе процессов, составляющих патогенетический базис формирования КВИ при ИВРЗ, ангиогенез занимает одну из ключевых позиций. Ангиогенез – это биологический процесс, при котором образуются кровеносные сосуды. В условиях ХПВ этот процесс обозначают ещё термином неоангиогенез, подчёркивая тем самым участие новообразованных сосудов в индукции и прогрессировании ХВП. Неоангиогенез является строго контролируемым процессом, при котором фундаментальную роль играют пролиферативная активность эндотелиоцитов и функциональные свойства этих клеток, приобретаемые ими при активации. Речь идёт о “высоких“ эндотелиоцитах 2 типа посткапиллярных венул. Как отмечалось выше, при выделении “физиологической системы соединительной ткани” по А. А. Богомольцу значительная роль отводилась функциональной активности эндотелиоцитов в норме и при патологических процессах. Этим обусловлено существующее до нынешнего времени другое обозначение этой системы – “ретикуло-эндотелиальная система”, впервые ведённое в начале 20 века немецким патологом К. А. Ашоффом. При ИВРЗ активированные эндотелиоциты, помимо участия в процессах неоангиогенеза, приобретают уникальные качества, связанные в т. ч. с приобретением ими некоторых свойств АГ-презентирующих клеток. Речь идёт о повышении экспрессии этими клетками аллелей МНС II класса под влиянием IFN I типа, провоспалительных хемо- цитокинов [129]. Этому способствует формирование фолликулоподобных структур (эктопический лимфоидный неогенез) и клеточное микроокружение, обеспечивающее продукцию и рецепцию провоспалительных цито- и хемокинов. Активное участие в процессах ангиогенеза при РА отводится межклеточным контактам макрофагов и фибробластов и продукции ими IL-6 и IL-8 [56].
Большое влияние на процесс ангиогенеза оказывают продукция и рецепция ангиогенных и ангиостатических факторов, а также соблюдение баланса между ними. В случае доминирования продукции и рецепции ангиогенных факторов “высоких“ эндотелиоцитов 2 типа, последние приобретают свойства, индуцирующие аутоиммунный ответ.
Ангиогенез – это запрограммированный каскад последовательных событий. В зоне воспаления ангиогенные факторы активируют эндотелиоциты, которые, в свою очередь, могут продуцировать протеолитические ферменты, в частности, матричные металлопротеиназы (ММП 1–9) и активаторы плазминогена. Это приводит к деградации базальной мембраны сосудов и перивакулярного внеклеточного матрикса. Эндотелиоциты пролиферируют и мигрируют в периваскулярную область и, таким образом, образуются “первичные сосудистые ростки”. Дальнейшая трансформация этих ростков приводит к образованию морфологически хорошо идентифицируемых “капиллярных петель” с последующим синтезом новой сосудистой мембраны и капиллярного образования. Эндотелиальные клетки высвобождаются из первичных ростков и петель, образуя вторичные и последующие генерации сосудистых образований [85,157]. Особенно ярко процесс неоангиогенеза представлен при РА, который считается важным фактором прогрессирования ревматоидного синовита. Подчёркивая патогенетическую важность этого процесса, некоторые авторы предлагают рассматривать РА в качестве “ангиогенной болезни” [155].
Ангиогенез регулируется сложным каскадом ангиогенных и ангиостатических факторов. Эти факторы могут быть отнесены к различным группам медиаторов системы иммунитета, а перечень и баланс этих факторов существенно разнится при ревматических заболеваниях. Так при РА, системной склеродермии, СКВ, при полимиозитах, при системных васкулитах к ангиогенным факторам относят:
– ростовые факторы – фактор роста фибробластов (FGF), сосудистый эндотелиальный ростовый фактор (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF). Эти факторы могут освобождаться в процессе дезорганизации соединительнотканного матрикса. К этой же группе относят также фактор роста тромбоцитов (PDGF), тромбоцит-активирующий фактор (PAF), эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста бетта (TGF-β), инсулиноподобный фактор роста I. VEGF является ключевым регулятором ангиогенеза при воспалении. Он необходим для пролиферации и миграции эндотелиальных клеток. Также этот ростовый фактор стимулирует ангиогенез, индуцируя экспрессию циклооксигеназы 2. VEGF вырабатывается в ответ на стимуляцию цитокинами, такими как TNF-α, TNF-β и IL-1. VEGF высвобождается периваскулярными клетками и синовиальными фибробластами [80,134];
– провоспалительные цитокины – IL-1, IL-6, IL-8, IL-13, IL-15, TNF-α. Причём TNF-α может регулировать неоангиогенез через систему ангиопоэтина 1 и 2. Другие ангиогенные цитокины включают в себя гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, онкостатин M, фактор ингибирующий миграцию макрофагов [17, 138];
– провоспалительные хемокины и их рецепторы – IL-8 (CXCL8), эпителиально-нейтрофильный активирующий протеин-78 (ENA-78, CXCL5), соединительнотканный активирующий протеин-III (CTAP-III, CXCL6), монокин-индуцированный IFN-γ (MIG, CXCL9), моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1 (MCP-1, CCL2), макрофагальный воспалительный протеин-1α (MIP-1α, CCL3), лимфотаксин (XCL1), RANTES и др. Известно, что хемокины ELR-CXC являются мощными ангиогенными факторами, способными стимулировать хемотаксис эндотелиоцитов, в то время как большинство не-ELR-CXC хемокинов являются сильными ангиостатическими факторами, которые ингибируют хемотаксис эндотелиоцитов, вызванный хемокинами ELR-CXC. Хемокины ELR-CXC связываются с рецепторами CXCR2 и CXCR1, в то время как хемокины не-ELR-CXC связываются с рецепторами CXCR3, CXCR4 и CXCR5. Таким образом, хемокины CXC действуют как ангиогенные или ангиостатические факторы в зависимости от наличия мотива ELR [150,156]. Что же касается хемокиновых рецепторов, участвующих в процессах ангиогенеза, то при РА, СКВ определена экспрессия хемокиновых рецепторов на клетках воспалительного инфильтрата группы CXCR1–5, а также группы CCR1–10. При СКВ установлена связь с рецептором CCR4, экспрессирующимся на CD4+ клетках. Хемокиновые ангиогенные рецепторы CXCR2 и CXCR4, экспрессируются на активированных эндотелиоцитах. Напротив, экспрессия хемокинового рецептора CXCR3 способствует ингибированию ангиогенеза [62,112,119];
– компоненты деградации экстрацеллюлярного соединительнотканного матрикса – коллагена I типа, фибронектина, гепарина, ламинина, протеолитических ферментов (ММР1–9), активаторов плазминогена [143];
– некоторые адгезионные молекулы – VCAM-1, эндотелиальные интегрины β1, β2, β3, тромбоцитарные адгезионные молекулы PECAM, CD31, CD105. Эти молекулы адгезии экспрессируются на активированных эндотелиоцитах [153].
Не меньшее патогенетическое значение имеют ангиостатические факторы. К ним при РА, при системной склеродермии относят TGF-β, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-α, IFN-γ, хемокины группы ELR-CXC [19].
Интересны в этом отношении взаимоотношения между такими ангиогенными факторами как ангиопоэтины. Если ангиопоэтин 1 способствует неоангиогенезу, то ангиопоэтин 2, ингибируя активность ангиопоэтина 1, снижает интенсивность формирования новых сосудов в месте воспаления. А такие провоспалительные цитокины, как TNF-α и IL-1, могут стимулировать выработку ангиогенных хемокинов и факторов роста, также они увеличивают экспрессию молекул адгезии на эндотелиоцитах [108, 165].
Таким образом, в процесс ангиогенеза вовлечено большое количество разнородных ангиогеннных и ангиостатических факторов. Аутокринная и паракринная продукция и рецепция этих факторов всеми видами клеток воспалительного инфильтрата обеспечивает интенсивный ангиогенез в очаге продуктивного воспаления, что способствует распространению и прогрессированию процесса in situ. Баланс между этими факторами вносит свой вклад в направлении течения воспалительного процесса либо в сторону прогрессирования, либо в сторону стабилизации. Кроме этого, медикаментозные влияния на процесс ангиогенеза относят к числу наиболее перспективных лечебных мероприятий при лечении ИВРЗ.
Отметим важную роль в ангиогенезе Мф, находящихся в большом количестве в составе воспалительного инфильтрата. Эти клетки продуцируют ангиогенные хемокины CXCL8, CXCL5, CXCL1, CXCL7, CCL2, TNF, IL-15, IL-18, ангиогенные ростовые факторы – VEGF, фактор роста фибробластов, фактор роста гепатоцитов, тромбоцитарный фактор роста и некоторые металлопротеиназы (ММР1–9). Одновременно эти же клетки участвуют в ангиостатических эффектах, продуцируя CXCL10, CXCL9, IFN-γ и тканевые ингибиторы металлопротеиназ [154].
Таким образом, формирование КВИ во многом зависит от растворимых факторов ангиогенеза. Эти факторы могут взаимодействовать друг с другом, что приводит к пролонгированию ангиогенеза, но также они могут стимулировать выработку ангиостатических факторов (отрицательная обратная связь).
1.7. Аутоантигены как триггеры иммуновоспалительных процессов при ревматических заболеваниях
При интерпретации патогенетической значимости КВИ ключевым моментом является идентификация возможных триггеров как системного, так и местного воспалительного процесса. Не исключено, что с указанными процессами связан первый этап индукция аутоиммунного ответа на полипептиды, кислые и нейтральные мукополисахариды и другие полисахаридно-протеиновые комплексы, которые могут формировать субмикроскопические структуры [13].
Триггерами деполимеризации основного вещества соединительной ткани могут быть, прежде всего, вирусные и бактериальные инфекции, интоксикации, гипоксия и др. Особое внимание уделяется инфекционным агентам, прежде всего, в связи с наличием феномена перекрёстной реактивности, или молекулярной мимикрии, АГ-детерминант инфекционных агентов (в частности, стрептококковые АГ при РЛ) и ауто-АГ соединительной ткани. Кроме этого, инфекции могут повышать экспрессию костимуляторных молекул CD80 (В7–1) и CD86 (В7–2) на АПК, CD28 на Т-хелперах, CD40 на В-лимфоцитах, необходимых для презентации ауто-АГ и индукции аутоиммунного ответа. Вирусы, в частности вирус Эпштейн-Барра, могут стать причиной поликлональной активации В-клеток с двояким эффектом. Во-первых, усилением АГ-презентирующей функции В-клеток и, во-вторых, трансформации клонов В-клеток в плазматические клетки – продуценты ауто-АТ.
Важной характеристикой аутоиммунных заболеваний является утрата толерантности с собственным ауто-АГ и индукция иммунного ответа против ауто-АГ, сопровождающегося альтерацией клеток и тканей организма. Подсчитано, что приблизительно из десятка тысяч потенциальных молекул-мишеней только около 300 могут вызвать деструктивный аутоиммунный ответ. Их отличительной чертой является широкое представительство во многих гистогенетически и функционально различных типах клеток и тканей, и конечно же, в рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани. Диапазон наиболее важных целевых молекул включает в себя: ДНК-белковые комплексы, РНК-белковые комплексы, фосфолипидные белковые комплексы, простые белковые антигены и углеводные антигены [129]. Подобные целевые молекулы обнаруживаются в клеточных ядрах, в цитоплазме, во внутриклеточных органеллах и на клеточной мембране. Неудивительно, что спектр ауто-АТ при ревматических заболеваниях, включающий десятки наименований, направлен, прежде всего, на ядерный материал, несущий генетическую информацию и на аппарат белкового синтеза, т. е. на базисные биологические системы, обеспечивающие жизнедеятельность организма. Интересной и важной особенностью ауто-АГ при иммуновоспалительных системных заболеваниях является изменения их конформации и кластеризация, связанные с внутриклеточными структурами во время апоптоза [37]. Эти процессы влияют на возможность появления ауто-АГ в клетках воспалительного инфильтрата, в частности, в нейтрофилах (например, изменения в структуре эластазы, миелопероксидазы, гистонов) при СКВ [57].
Отличительной особенностью кандидатных ауто-АГ при ИВРЗ является наличие цитруллинированных белков (т. е. белков, содержащих в повышенном количестве аминокислоту цитруллин). Цитруллинированные белки являются продуктом посттрансляционной модификации и включать в себя АГ-детерминанты, индуцирующие аутоиммунный ответ. Эти белки (полипептиды) находятся в большом количестве в синовиальной жидкости, а также в находящихся в этой жидкости моноцитах и нейтрофилах [128].
“Цитруллинизация” также характерна, в частности, для клеток воспалительного инфильтрата при ревматоидном синовите. Предполагается, что при эрозивном воспалении синовиальной оболочки при РА “гиперцитруллинизации” КВИ сопровождается усилением цитолитической активности CD8+ лимфоцитов. Сенсибилизированные CD8+ лимфоциты in situ реализуют свой цитолитический потенциал по отношению к ауто-АГ клеток-мишеней синовиальной оболочки за счёт перфоринового механизма и с участием системы комплемента. Показано, что наличие активированных цитотоксических CD8+лимфоцитов, экспрессирующих протеолитический фермент гранзим В (GrB), является одними из лучших предикторов эрозивного синовита при РА [44].
Таким образом, наличие повышенного количества цитруллина на клетках синовиальной оболочки может индуцировать иммуноопосредованные мембранолитические механизмы эрозивного синовита при РА.
Имеются данные, свидетельствующие о значительной роли указанной выше посттрансляционной модификации структуры и цитруллинизации ауто-АГ при РА. Речь идёт о презентации ауто-АГ аллелями МНС I и II класса CD4+ и CD8+ клеткам-эффекторам ревматоидного синовита. Показана статистически значимая ассоциация аллелей HLA-DRB1 с РА. В частности, аминокислотные позиции 11, 13, 71 и 74 полипептидной цепи HLA-DRβ1, кодируемой аллелями SE, вносят наиболее значительный вклад в риск развития ревматоидного синовита [123]. Эти аминокислотные позиции обуславливают феномен перекрестной презентации (антигенной мимикрии). Полипептидная цепь HLA-DRβ1 является высокоцитруллинированной. Выработка ауто-АТ к ауто-АГ в составе полипептидного продукта аллеля HLA-DRβ1 является специфичной для РА [137]. Определен карман P4 в АГ-связываюшей щели белковой молекулы МНС II класса, кодируемой аллелем HLA-DRB1 * 04: 01, который конформационно наилучшим образом подходит к цитруллинированным антигенным детерминантам [135].
При РА цитруллинированные пептиды могут генерироваться в изобилии, особенно в случае описанных выше иммуноопосредованных мембранолитических механизмов эрозивного синовита при РА [128]. Презентация цитруллинированных антигенных детерминант в составе аллелей HLA-DR может являться ключевым молекулярно-генетическим событием при индукции аутоиммунного ответа при РА. Есть также свидетельства того, что посттрансляционные модификации конкретных аутоантигенов, могут быть осуществлены путём процессов фосфорилирования и ацетилирования [161].
Приблизительно у 2/3 пациентов с РА определяются ауто-АТ к цитруллинированным белкам [115].
Синовиальные В-клетки продуцируют ауто-АТ, и анализ репертуара В-клеточных рецепторов показывает, что В-клетки памяти, активированные в синовиальных агрегатах, могут дифференцироваться в плазматические клетки локально внутри ткани, даже в отсутствие герминативных центров (GC) в эктопических лимфоидных структурах [71, 100].
Важные данные касаются способности мембранных и цитоплазматических паттерн-распознающих рецепторов клеток врождённого иммунитета – TLR-, NOD- и RIG-рецепторов взаимодействовать с ауто-АГ. Показано, что активация В-лимфоцитов с последующей трансформацией в плазматические клетки, продуцентов ауто-АТ, может быть усилена ауто-АГ, которые связываются с рецептором В-лимфоцитов (BCR) и эндосомными TLR7 и TLR9 [93, 94].
Есть данные о том, что дефицит TLR9 блокирует индукцию ауто-АТ против ДНК на мышиной модели СКВ. Дефицит TLR7 также предотвращает образование ауто-АГ против рибонуклеопротеинов и уменьшает тяжесть течения СКВ [39].
Таким образом, способность к связыванию и активации эндосомных TLR на В-лимфоцитах является важным фактором, определяющим иммуногенность ДНК- и РНК-содержащих ауто-АГ.
Указанная выше способность целевых ауто-АГ взаимодействовать с паттерн-распознающими рецепторами клеток врождённого иммунитета (TLR, NOD и RIG), фагоцитарная активность Мф и ДК по отношению к продуктам деструкции основного вещества соединительной ткани обеспечивает протеолитическую презентацию ауто-АГ Th1 CD4+лимфоцитам в составе аллелей МНС класса II и CD8+ лимфоцитам в составе аллелей МНС класса I, находящихся в КВИ. Протеолиз, катализируемый каспазами, катепсинами и гранзимом В (GrB), влияет на связывание аллелей МНС I и II класса с конкретными ауто-АГ в процессе антигенной презентации, что показано при СКВ, миозите и при РА [44].
В экспрессии ауто-АГ при ИВРЗ большое значение придаётся активности матриксных металлопротеиназ (ММР). ММР представляют собой группу из более чем 20 цинк-содержащих протеиназ, взаимодействующих с компонентами основного вещества соединительной ткани и базальных мембран, в число которых входят коллагеназа и эластаза. Они являются активными участниками ремоделирования волокнистой соединительной ткани и приобретения ею ауто-АГ свойств. ММП ответственны за расщепление компонентов экстрацеллюлярного матрикса, потерю протеогликанов, что имеет место, в частности, при суставной деструкции при РА [109]. Протеолитические эффекты этих ферментов сопровождаются деградацией внеклеточного матрикса соединительной ткани и прежде всего коллагенового каркаса, преимущественно коллагена III типа. Эти процессы сопровождаются появлением в очаге воспаления фрагментов коллагена, включающих три аминокислоты – пролин-глицин-пролин (PGP). PGP-фрагменты обладают выраженной хемотактической активностью по отношению к клеткам макрофагально-моноцитарного ряда и нейтрофилов. Накапливаясь в больших количествах в соединительнотканном матриксе, коллагеновые PGP-фрагменты оказывают выраженный провоспалительный эффект. Кроме этого, подобные и другие фрагменты коллаген-эластического каркаса, появляющиеся в результате протеолитического действия всех 9 видов ММР (напомним, что коллагеназа и эластаза относятся к группе ММР) активно фагоцитируются клетками макрофагально-моноцитарного ряда in situ с последующей презентацией CD4+ и CD8+лимфоцитам в качестве ауто-АГ и индукцией аутоиммунного ответа [27, 86, 90].
В очаге ХПВ существенно усиливается активность ММР-8 и ММР-9. В зависимости от компонента основного вещества соединительной ткани, базальных мембран и синовиальной оболочки суставов, с которым они взаимодействуют, ММР разделяют на коллагеназы (ММР-1, – 8, – 13), желатиназы А и В (ММР-2, – 9), стромелизины (ММР-3, – 10, – 11), матрилизины (ММР-7, – 26). Активность ММР-1, – 3, – 9, – 8, – 13 индуцируется IL-1β, TNF-α и тканевой гипоксией. Некоторые ММР (ММР-1, – 13) продуцируются фибробластами и эндотелиоцитами, принимающими участие в процессах ангиогенеза, в частности, при РА [33, 118].
Значительная роль в презентации ауто-АГ принадлежит посттрансляционной модификации структуры ауто-АГ. Наличие конкретных аллелей МНС класса I и II на АГ-презентирующих клетках КВИ обуславливает статистически значимые ассоциации ревматических заболеваний с аллельными вариантами МНС, определяющих генетическую предрасположенность к ИВРЗ. Эти процессы обеспечивают синхронизированную активацию механизмов врождённого и адаптивного иммунитета, как in situ, так и при системных проявлениях.
Необходимо отметить, что специфичность TLR-, NOD- и RIG – рецепторов на АГ-презентирующих клетках в составе КВИ обеспечивает взаимодействие также и с нуклеиновыми кислотами бактерий и вирусов и биохимическими производными их ДНК и РНК, являющихся одними из основным кандидатов на роль триггеров иммуновоспалительного процесса при ревматических заболеваниях и формирования КВИ. В частности, речь идёт о вирусах краснухи, японского энцефалита, простого герпеса, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барра [60, 111].
В схемах иммунопатогенеза ревматических заболеваний большое внимание уделяется феномену антигенной перекрёстной (кросс) презентации. Речь идёт о фагоцитозе и о внутриклеточном ограниченном протеолизе продуктов дезорганизации рыхлой волокнистой соединительной ткани клетками макрофагально-моноцитарного ряда, дендритными клетками различного гистогенеза, клетками Лангерганса. Процессинг пептидов коллагенового каркаса, продуктов деполимеризации основного вещества, некробиотически изменённых клеток, вирусных и бактериальных инфекционных агентов в очаге воспаления и последующая презентация в составе молекул МНС класса I активированным CD8+ Т-лимфоцитам является важным аспектом перекрёстной презентации. Активность коллагеназ, эластаз и других металлопротеиназ (ММР), вызывающих разволокнение и деструкцию коллагеновых и эдастических волокон – хорошо документированнный факт. На этом этапе формируются перекрест АГ-детерминант рыхлой волокнистой соединительной ткани с изменёнными ауто-АГ и АГ флогогенных агентов. Некоторые аспекты молекулярных процессов АГ перекреста изучены. В частности, показано, что процессинг упомянутых выше пептидов и внеклеточных белков, доставляемых в эндосомы и фагосомы, происходит за счёт цитозольной транслокации эндосомальных антигенов и связывания с протеосомальным комплексом вне эндоплазматического ретикулума (ER), где реализуется классический путь презентации пептидов в комплексе с MHC класса I TCR CD8+ клеток [26].
В процессе перекрёстной презентации могут участвовать внутриклеточные белки теплового шока, такие как HSP70 и HSP90. Известно, что клетки, подвергающиеся некробиотическим изменениям, экспрессируют повышенные уровни HSP и являются мишенью для фагоцитирующих клеток. HSP относятся к системе эндогенных сигналов опасности – аларминам (DAMP) и они экспрессируются при некротическом повреждении клеток и клеточном стрессе. Внутриклеточные HSP, такие как HSP70 и HSP90, могут участвовать в цитозольной транслокации эндосомальных антигенов или связываться с протеасомой, позиционируя их для приема пептидов по мере их образования. Распознавание макрофагами ассоциированных с мембраной некротических и некробиотических клеток молекул HSP70 и HSP90 с помощью лектиноподобного окисленного рецептора LDL 1 способствует перекрестному представлению клеточных антигенов [110, 174].
Эффективная перекрестная презентация осуществляется in vivo с помощью CD24+ дендритных клеток, экспрессирующих костимуляторные молекулы, необходимые для активации CD8+ клеток. Экспрессия костимуляторных молекул является результатом активации внутриклеточных сигнальных путей после взаимодействия TLR4- и TLR9- рецепторов с лигандами упомянутых выше продуктов дезорганизации основного вещества соединительной ткани и коллагенового каркаса. Не исключается участие инфекционных, в частности, вирусных агентов. ДК привлекаются в очаг воспаления хемокинами CCL3 и CCL4 [127]. Клетки Лангерганса, единственного типа ДК в эпидермисе кожи, также участвуют в АГ перекресте посредством рецепторов XCR1 и CLEC9A [20, 139, 163].
Как отмечалось выше аутоиммунный ответ при ИВРС может быть обусловлен в т. ч. и перекрестной реактивностью (кросс-реактивностью) АГ-детерминант инфекционных агентов и соединительной ткани. При этом модель молекулярной мимикрии, в которой инфекции (бактерии, вирусы) выступают в качестве кандидатных триггеров, является наиболее обоснованной как с клинической точки зрения, так и подтверждённой многочисленными экспериментальными данными [15,72]. Известно, что вирусная инфекция, взаимодействуя с TLR рецепторами, экспрессирующихся на плазмацитоидных ДК в составе КВИ, является мощным стимулом активации последних и продукции ими провоспалительных цитокинов – IFN I типа, TNF-α, TNF-β IL-1β и др., мобилизации CD4+ и CD8+лимфоцитов и других клеток воспалительного инфильтрата. Подобный механизм изучен в отношении вирусов Эпштейн-Барра, кори, парвовируса В19 при РА, СКВ, синдроме Шегрена, дерматомиозита [117,147].